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一、研究背景

制藥與生物技術產(chǎn)業(yè)中，生物反應器的發(fā)酵過程是一個復雜的動態(tài)系統(tǒng)，細胞生長、代謝及目的產(chǎn)物合成受溫度、pH、溶解氧（DO）、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等多重因素調(diào)控。傳統(tǒng)監(jiān)測方法（如離線取樣結合HPLC、細胞計數(shù)板）存在檢測周期長、樣本消耗量高、操作繁瑣等缺陷，難以實時反映發(fā)酵體系的動態(tài)變化，易導致工藝參數(shù)失控，影響產(chǎn)品收率與質(zhì)量一致性。因此，開發(fā)高通量、快速、精準的監(jiān)測技術成為產(chǎn)業(yè)迫切需求。

酶標儀作為基于抗原-抗體特異性結合、酶促反應顯色原理的分析儀器，具有檢測速度快、樣本需求量少、自動化程度高等優(yōu)勢，已廣泛應用于生命科學研究。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標儀在傳統(tǒng)酶標儀基礎上優(yōu)化了光學系統(tǒng)與檢測算法，具備微孔板高通量分析及數(shù)據(jù)實時導出功能，但其在生物反應器工業(yè)級監(jiān)測中的系統(tǒng)性應用研究尚未見報道。

二、材料與方法

（一）實驗儀器與試劑

1、核心儀器：博清生物酶標儀；對照儀器：自動細胞計數(shù)儀。

2、試劑：細胞密度檢測試劑盒、葡萄糖/乳酸檢測試劑盒、谷氨酰胺/谷氨酸檢測試劑盒、單克隆抗體檢測試劑盒；CHO-K1細胞、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清；發(fā)酵液常見雜質(zhì)。

（二）實驗設計

1、檢測方法建立

細胞密度（CD）：采用MTT法，取發(fā)酵液樣本10μL，與90μL MTT工作液混合，37℃孵育4h后，酶標儀檢測570nm處吸光度（OD570），建立OD值與細胞濃度的標準曲線。

代謝產(chǎn)物（Glc、Lac、Gln、Glu）：按照試劑盒說明書操作，分別檢測505nm（Glc）、570nm（Lac）、340nm（Gln/Glu）處吸光度，結合標準曲線計算濃度。

目的蛋白（抗PD-1單抗）：采用間接ELISA法，包被抗原（PD-1蛋白），加入稀釋后的發(fā)酵液樣本，二抗標記HRP，TMB顯色后檢測450nm處吸光度，定量蛋白濃度。

2、方法學驗證

線性范圍：配制系列濃度標準品（CD：1×103~1×10?cells/mL；Glc：0~50mmol/L；Lac：0~30mmol/L；Gln：0~10mmol/L；Glu：0~5mmol/L；單抗：0~100μg/mL），檢測吸光度并進行線性回歸分析。

精密度：同一批次樣本重復檢測6次（批內(nèi)精密度），連續(xù)3天檢測同一批次樣本（批間精密度），計算變異系數(shù)（CV）。

準確度：向已知濃度的發(fā)酵液樣本中加入不同比例標準品，計算回收率。

特異性：向樣本中加入發(fā)酵液常見雜質(zhì)（終濃度：蔗糖50g/L、甘油20g/L、吐溫80 1 g/L），檢測吸光度變化率。

3、實際發(fā)酵工藝監(jiān)測

采用CHO-K1細胞表達抗PD-1單抗，5L生物反應器發(fā)酵14天，分別于0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288h取樣，使用博清生物酶標儀與對照儀器同步檢測各指標，對比檢測結果一致性及動態(tài)變化趨勢。

三、結果與分析

（一）方法學驗證結果

1、線性范圍

博清生物酶標儀檢測各指標的線性范圍及相關系數(shù)顯示，所有指標的R2均≥0.995，表明標準曲線線性關系良好，可覆蓋生物反應器發(fā)酵過程中各指標的濃度變化范圍。

2、精密度與準確度

批內(nèi)與批間精密度結果顯示，各指標CV值均≤3.2%，表明儀器檢測重復性良好；回收率在95.8%~103.6%之間，符合生物檢測方法的準確度要求（回收率 90%~110%）。

3、特異性

添加發(fā)酵液常見雜質(zhì)后，各指標吸光度變化率均≤2.5%，表明博清生物酶標儀檢測不受雜質(zhì)干擾，特異性良好。

（二）實際發(fā)酵工藝監(jiān)測結果

1、檢測結果一致性

博清生物酶標儀與對照儀器（細胞計數(shù)儀、HPLC）檢測結果的相關性分析顯示，各指標的相關系數(shù)均≥0.990，表明兩種方法檢測結果高度一致，博清生物酶標儀可替代傳統(tǒng)方法用于實際發(fā)酵監(jiān)測。

2、發(fā)酵過程動態(tài)監(jiān)測

CHO-K1細胞發(fā)酵14天的動態(tài)監(jiān)測結果顯示：細胞密度在0~72h快速增長，72h達到峰值（8.6×10?cells/mL），隨后進入穩(wěn)定期；葡萄糖濃度隨細胞生長持續(xù)下降，72h后降至5mmol/L以下；乳酸濃度在48h達到峰值（22.3mmol/L），隨后緩慢下降；谷氨酰胺濃度在96h耗盡，谷氨酸濃度同步升高；抗PD-1單抗?jié)舛仍?2h后開始顯著上升，288h達到最高值（89.6 μg/mL）。博清生物酶標儀可實時捕捉上述動態(tài)變化，為工藝參數(shù)調(diào)整（如補料時機、DO調(diào)控）提供精準數(shù)據(jù)支持。

  3、檢測效率對比

與傳統(tǒng)方法相比，博清生物酶標儀的檢測效率顯著提升：單樣本檢測時間從HPLC的30~60min、細胞計數(shù)儀的10min 縮短至5min以內(nèi)；96孔板高通量檢測可同時處理80個以上樣本，單日檢測量提升40%；樣本消耗量從HPLC的500μL、細胞計數(shù)儀的20μL減少至10μL，樣本損耗降低80%。

四、討論

生物反應器監(jiān)測的核心需求是“實時、精準、高效”，這直接影響發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性與產(chǎn)品質(zhì)量。本研究中，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標儀通過優(yōu)化的光學系統(tǒng)與特異性檢測試劑盒，實現(xiàn)了細胞密度、代謝產(chǎn)物及目的蛋白的一體化監(jiān)測，其方法學驗證結果符合生物檢測標準，表明儀器具備工業(yè)級應用的可靠性。

與傳統(tǒng)方法相比，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標儀的核心優(yōu)勢體現(xiàn)在三方面：（1）高通量與低成本：96孔板設計適配規(guī)?；a(chǎn)的批量檢測需求，樣本消耗量減少80%，降低試劑成本與廢液處理壓力；（2）實時性與便捷性：檢測周期縮短至5min以內(nèi)，數(shù)據(jù)可實時導出至工藝控制系統(tǒng)，支持動態(tài)調(diào)整補料策略與環(huán)境參數(shù)，減少工藝波動；（3）特異性與抗干擾能力：針對發(fā)酵液復雜基質(zhì)優(yōu)化的檢測方法，可有效規(guī)避蔗糖、甘油等雜質(zhì)的干擾，保障檢測準確性。

在實際發(fā)酵監(jiān)測中，博清生物酶標儀成功捕捉了CHO-K1細胞生長、代謝及單抗合成的動態(tài)規(guī)律：72h細胞密度峰值與葡萄糖耗盡時機的同步性，提示需在48~72h進行葡萄糖補料；乳酸濃度在48h后的下降趨勢，反映細胞代謝模式從糖酵解向氧化磷酸化轉變；谷氨酰胺耗盡與谷氨酸積累的相關性，為谷氨酰胺補料策略提供依據(jù)。這些數(shù)據(jù)驗證了儀器在工藝優(yōu)化中的實用價值，可幫助企業(yè)提升產(chǎn)品收率與質(zhì)量一致性。

本研究的局限性在于未探究極端發(fā)酵條件（如高鹽、高黏度發(fā)酵液）對檢測結果的影響，未來可進一步拓展儀器在特殊工藝（如連續(xù)流發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵）中的應用研究；同時，結合物聯(lián)網(wǎng)技術實現(xiàn)酶標儀與生物反應器的在線聯(lián)動，構建智能化監(jiān)測系統(tǒng)，將是后續(xù)研究的重點方向。

本研究建立了博清生物酶標儀檢測生物反應器關鍵指標的標準化方法，通過方法學驗證與實際發(fā)酵工藝監(jiān)測，證實該儀器具有線性范圍寬、精密度高、準確度好、特異性強及檢測效率高等優(yōu)勢，可有效替代傳統(tǒng)檢測方法用于細胞密度、代謝產(chǎn)物及目的蛋白的實時監(jiān)測。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標儀的應用不僅降低了制藥與生物技術產(chǎn)業(yè)的監(jiān)測成本，提升了工藝控制精度，還為發(fā)酵過程的智能化升級提供了核心技術工具，具有重要的產(chǎn)業(yè)應用價值與推廣前景。